摘要：

通过激酶抑制剂治疗将诱导敏感细胞耐药性的产生，而这种耐药性会受到肿瘤细胞微环境的影响。治疗诱导的分泌物由许多上调或者下调的分泌因子组成。他们渗入治疗后的肿瘤衰退细胞的微环境，将继续刺激肿瘤的生长。本文就主要探讨抗药性限制激酶抑制剂对肿瘤的治疗疗效。研究显示，BRAF，ALK或EGFR激酶抑制剂的靶标疗法会诱导一系列分泌物的产生。分泌物能够进一步刺激肿瘤细胞生长、浸染及转移，并使肿瘤细胞产生耐药性。威罗菲尼片治疗下调转录因子FRA1，刺激黑素瘤细胞分泌物的产生。对肿瘤微环境退化条件下的耐药黑素瘤进行原位转录分析，发现有多条通路被激活，特别是AKT通路。研究发现，细胞内RAF和PI(3)K/AKT/mTOR信号通路的双重抑制，能够减弱人类黑素瘤BRAF突变耐药细胞的增殖。这表明，双重抑制可能作为一种治疗肿瘤复发的途径。致癌因子的抑制可以诱导药物敏感细胞分泌物的显著变化，从而建立起由耐药细胞产生的微环境，但对于联合治疗手段依旧敏感。

 

一、先天耐药细胞影响大

威罗菲尼片，厄洛替尼和克唑替尼都可以治疗BRAF突变黑素瘤，EGFR突变或者ALK异位腺癌。大部分患者出现局部的病情衰退或稳定；然而，在6~12个月左右就能产生耐药性，限制了长期治疗疗效。这种耐药性可能是因为一小部分先天耐药性细胞的存在，这些细胞如何在肿瘤衰退过程中造成细胞微环境的巨大改变依旧不为人所知，这一点对于提升当前药物的治疗效果有着极大意义。

为了模拟肿瘤细胞的体外靶标疗法，将抗威罗菲尼人A375黑素瘤细胞 (A375^R)、标记了TK-GFP-荧光素酶的载体、未标记的载体以及威罗菲尼敏感细胞，混合 (A375/A375^R，99.95/0.05%)注射入小鼠体内。结果显示，威罗菲尼治疗减少敏感肿瘤细胞，但却导致混合细胞A375/A375^R的增加。威罗菲尼或对照载体处理，对只含有抗性细胞的细胞系的变化影响无较大差别，揭示肿瘤衰退处抗性细胞的产生并非直接受到威罗菲尼的影响。

A375^R和其他威罗菲尼敏感黑素瘤细胞(Colo800, LOX and UACC62)一起培养，威罗菲尼治疗组细胞增长较对照组（注射对照载体）高8倍。患者黑素瘤细胞系M249^R及其威罗菲尼耐药细胞系也能发现这种耐药性成倍增长。人肺腺癌细胞因子诱导的鼠肿瘤可以用克唑替尼和厄洛替尼治疗，用同样的细胞系产生的耐药细胞或者黑素瘤耐药细胞进行混合，同样会诱导耐药细胞的产生。耐药细胞的持续增长将诱导肿瘤细胞的高转移率。

肿瘤细胞的循环造成肿瘤渗透，这种现象被称为“自给籽晶”，导致肿瘤耐药细胞到达转移位点。在小鼠体内植入A375敏感肿瘤细胞，再加入威罗菲尼或者对照载体，同时注入TGL标记的A375^R细胞后发现，用威罗菲尼治疗后，在肿瘤衰退处会吸引更多的A375^R细胞。为了评估耐药肿瘤细胞转移“自给籽晶”现象，研究人员向患病小鼠体内注射A375^R细胞或者对照载体，检测威罗菲尼处理后肿瘤量的多少。结果显示，对照组肿瘤衰退，而A375^R细胞的注入则诱导了肿瘤的复发。这说明靶标治疗产生的肿瘤衰退处对耐药细胞的吸引更强，进而诱导肿瘤的持续发生。

 

二、肿瘤细胞微环境的重要性

肿瘤由一系列微环境构成，这些微环境包括基质以及肿瘤细胞。微环境的调节作用导致肿瘤的生长以及耐药性的产生。在假设药物敏感细胞是靶标治疗的主要受体后，研究人员进一步推测，敏感肿瘤细胞受到激酶抑制剂治疗而产生的信号是诱导耐药肿瘤细胞产生的主要原因。

为了验证这个假设，研究人员进行了一系列的实验。向表达TGL的A375^R细胞加入或者不加入敏感细胞，再用激酶抑制剂治疗或者载体作为对照。而为了验证之前的体内实验，他们用威罗菲尼、厄洛替尼和克唑替尼共培养敏感肿瘤细胞，结果发现，该处理极大地刺激了耐药细胞的增长。在通过威罗菲尼治疗(CM-vemurafenib)及对照组（CM-vehicle）实验，并收集培养基后发现，威罗菲尼治疗组培养基极大地增加了黑素瘤耐药细胞的产生。同样，收集用克罗替尼和厄洛替尼治疗的肿瘤细胞培养基，也能刺激肺腺癌细胞耐药性的产生。Transwell实验也发现，威罗菲尼治疗组肿瘤细胞培养基也能增加细胞的转移能力。值得一提的是，CM-vemurafenib处理组能够增加细胞的生存能力，并且抑制自噬的caspase活性，其活性与CM- vehicle处理组相差大概100倍。这些结果说明BRAF，ALK 和 EGFR突变细胞的治疗压力来源于细胞分泌物，而这些分泌物能够延长耐药细胞的生存，增加耐药细胞的比率。这与之前的细胞内信号反馈抑制机制有一定的冲突。

 

三、分泌物的组成

为了明确这些分泌物的大致组成，研究人员在体外用威罗菲尼治疗敏感性A375细胞，并在不同时间点收集细胞，检测相关基因的表达变化情况。威罗菲尼治疗6h后，结果显示473个基因表达发生了变化，且都是与转录相关的调控因子。而48h后，这些转录物组1/3以上发生了变化，与威罗菲尼处理5天后的A375肿瘤细胞基因表达重叠极大。同样的结论，在威罗菲尼处理的Colo800和UACC62黑素瘤细胞内也产生了相似的结果。尽管是不同的细胞系，不同的致癌基因，不同的治疗手段，黑素瘤和肺腺癌的肿瘤分泌物基因表达情况都极为相似(P<9.11X10^-5)。而且，黑素瘤敏感细胞分泌物的变化与免疫细胞，基质细胞的变化较为一致。这些结果显示，“治疗诱导分泌物”（TIS）形式是存在的，且分泌物是由许多上调或者下调的分泌因子组成。他们渗入治疗后的肿瘤衰退细胞的微环境，继续刺激肿瘤的生长。

 

四、FRA1、PI(3)K/AKT与TIS

为了验证威罗菲尼治疗后A375-TIS反应的分子驱动机制，研究人员通过转录因子结合基序分析威罗菲尼治疗6h及48h后转录因子的表达变化，最终发现了FRA1（也即FOSL1）在其中的重要性。FRA1是AP1转录因子复合体的成员之一，能够激活ERK途径，是TIS的上游调节因子。

为了验证FRA1在TIS产生的作用，研究人员运用RNAi技术进行干扰。缺失FRA1的A375细胞产生的转录因子变化和威罗菲尼诱导的情况一致。A375^R细胞和A375/ UACC62细胞共同培养，转入shFRA1，诱导肿瘤的快速发生。A375-shFRA1也能够吸引更多的耐药细胞聚集。由此得知，FRA1下调诱导威罗菲尼治疗后肿瘤分泌物的产生。

为了测定耐药细胞的反应性分泌情况，研究人员在A375R细胞中表达了核糖体蛋白L10a (RPL10a)，并与GFP蛋白相连接(eGFP–RPL10a)。对表达数据进行通路分析，发现有数个通路被激活，这些通路包括PI(3)K/AKT，BMP-SMAD 和NFkB。PI(3)K/AKT途径的激活也表明PI(3)K/mTOR抑制剂的弱点存在。PI(3)K/AKT也是TIS过程中被激活的主要通路。

TIS包含的许多因子可以直接或者间接激活AKT通路。药物治疗过程中上调的因子包括IGF1， EGF，ANGPTL7 和 PDGFD，它们都能够激活AKT通路。IGF1是其中效果最为明显的因子，它同时在肿瘤基质中高表达。而它的抑制因子IGFBP3则在TIS过程中被下调，导致AKT的激活和耐药细胞增值。

 

五、AKT、TIS和肿瘤增殖

为了验证AKT在TIS诱导的肿瘤增殖中的作用，研究人员联合应用了威罗菲尼和AKT/PI(3)K/mTOR抑制剂。结果表明，MAPK和AKT双重抑制减弱了TIS诱导的肿瘤细胞增殖优势。当研究人员向小鼠注入A375/A375^R或者A375^R细胞，并用威罗菲尼和AKT (MK2206)/ PI(3)K/mTOR抑制剂共同处理后，发现MAPK 和PI(3)K/AKT/mTOR的抑制极大的限制了威罗菲尼耐药细胞的产生。但这种抑制只在肿瘤衰退微环境中起作用。

 

总结

靶标治疗的限制作用以往曾被归因于细胞内的回馈回路或者特殊的细胞活素。本文的结果显示，靶标抑制诱导细胞耐药性的产生。TIS不仅能够延长药物敏感细胞的生存，同时能够帮助耐药细胞的生长和转移。TIS是活细胞对于抑制剂的治疗反应，由许多转录因子和细胞内信号通路所调控。因此，要想保证长期治疗效果，就必须从根本上改变治疗模式。

（来源：百替生物   作者：黄璜）

 

 

原文摘要：

Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression

Drug resistance invariably limits the clinical efficacy of targeted therapy with kinase inhibitors against cancer. Here we show that targeted therapy with BRAF, ALK or EGFR kinase inhibitors induces a complex network of secreted signals in drug-stressed human and mouse melanoma and human lung adenocarcinoma cells. This therapy-induced secretome stimulates the outgrowth, dissemination and metastasis of drug-resistant cancer cell clones and supports the survival of drug-sensitive cancer cells, contributing to incomplete tumour regression. The tumour-promoting secretome of melanoma cells treated with the kinase inhibitor vemurafenib is driven by downregulation of the transcription factor FRA1. In situ transcriptome analysis of drug-resistant melanoma cells responding to the regressing tumour microenvironment revealed hyperactivation of several signalling pathways, most prominently the AKT pathway. Dual inhibition of RAF and the PI(3)K/AKT/mTOR intracellular signalling pathways blunted the outgrowth of the drug-resistant cell population in BRAF mutant human melanoma, suggesting this combination therapy as a strategy against tumour relapse. Thus, therapeutic inhibition of oncogenic drivers induces vast secretome changes in drug-sensitive cancer cells, paradoxically establishing a tumour microenvironment that supports the expansion of drug-resistant clones, but is susceptible to combination therapy.

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