CAR-T细胞在B细胞恶性肿瘤中产生了前所未有的疗效，最显著的是CAR-T细胞中用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），完全缓解率高达90％。然而，肿瘤抗原逃逃避免疫系统的攻击（癌细胞免疫逃避）已经成为CAR-T细胞治疗B细胞恶性肿瘤的主要挑战。此外，CAR-T在转移性实体瘤和正常组织中的on target/off-tumor导致的安全性问题成为该治疗成功过程中的重要阻碍。本文综述了抗原缺失复发的一些机制和解决这个问题的新策略。此外，新的CAR设计是我们考虑增强实体肿瘤中CAR-T细胞治疗的安全性的途径之一。

撰文丨板栗

责编丨刀刀

CAR-T细胞在B细胞恶性肿瘤中产生了前所未有的疗效，最显著的是CAR-T细胞中用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），完全缓解率高达90％。然而，肿瘤抗原逃逃避免疫系统的攻击（癌细胞免疫逃避）已经成为CAR-T细胞治疗B细胞恶性肿瘤的主要挑战。此外，CAR-T在转移性实体瘤和正常组织中的on target/off-tumor导致的安全性问题成为该治疗成功过程中的重要阻碍。本文综述了抗原缺失复发的一些机制和解决这个问题的新策略。此外，新的CAR设计是我们考虑增强实体肿瘤中CAR-T细胞治疗的安全性的途径之一。

嵌合型抗原受体（CAR）包括一个肿瘤相关抗原结合区（通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段），一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区（CD28，CD137，CD134）。通过基因转移技术工程化表达CAR的T细胞能够通过scFv结合结构域特异性识别其靶抗原，导致MHC -非依赖性方式的T细胞活化。

在过去几年中，一些机构的临床试验结果证明了通过靶向CD19，CD20或CD30的CAR-T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤包括B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），B细胞非霍奇金淋巴瘤（B- NHL），慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和霍奇金淋巴瘤（HL）是有疗效的，特异性CAR-T细胞对于B-ALL的缓解率高达70〜94％。这种显著的疗效将会导致B细胞恶性肿瘤的治疗的变革，也打开了CAR-T细胞治疗实体瘤的应用大门。尽管CAR-T细胞治疗为部分晚期肿瘤患者带来治愈的希望，但在治疗过程中具有一定的不良反应，已有报道证实了由CAR-T细胞的肿瘤外交叉反应引起的快速死亡，因此在开展CAR-T细胞治疗时，安全性尤为重要。

总体而言，未来CAR-T细胞治疗的广泛应用仍然存在几个强大的挑战：

（1）抗原缺失复发—主要在抗CD19的CAR-T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病中观察到，是对CAR-T细胞治疗的新威胁

（2）通过CAR-T细胞识别健康组织导致on target/off-tumor的毒性可以引起严重的不良反应甚至危及生命，特别是在实体瘤的环境中。

（3）实体瘤中的疗效较低—主要是由于肿瘤微环境的影响

（4）单个自体细胞制备的局限性很难实现细胞治疗的工业化制备

针对如何克服这些障碍，韩教授提出了CAR-T细胞治疗优化的主要方向，包括克服抗原缺失复发、增强其有效性和安全性。

这篇综述具体从以下4个方面分析了CAR-T细胞治疗的未来方向：

1、如何克服血液恶性肿瘤中的抗原丢失复发

2、如何提高实体瘤中CAR-T细胞的安全性

3、提高CAR的选择性

4、控制CAR-T细胞活性

如何克服血液恶性肿瘤中的抗原缺失复发

抗原缺失复发是对CAR-T细胞治疗的新威胁，主要在抗CD19的CAR-T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病中观察到，在跨机构的约14％的儿科和成人应答者中也观察到（表1），在CLL和原发性纵隔大B细胞淋巴瘤（PMLBCL）中也有记录。事实上，在接受blinatumomab的患者中也注意到了这一点，这意味着这种特异性逃避可能是CD19定向T细胞免疫治疗的选择性压力。此外，当超过CD19时，也可以看到由CAR-T细胞治疗施加的选择压力导致的肿瘤编辑；实际上，在实体瘤的实验研究中也报道了抗原逃避。这些发现表明，用特异性靶向治疗总是带有肿瘤编辑的风险，这表明预防和治疗抗原缺失逃避的方法在该领域中的垂直进展。

鉴于迄今涉及CD19的广泛试验，我们对这些现象的机制获得了更好的理解。尽管这些抗原逃避复发的特征是肿瘤细胞表面上缺失可检测的CD19，但是涉及多种机制。一种机制是CD19仍然存在，但是不能被抗CD19 CAR-T细胞检测和识别；另一种机制是抗CD19 CAR-T细胞所必需的同源CD19表位的缺失。在抗CD19 CAR-T细胞输注后2个月通过PMLBCL持续性肾受累的患者的肾损伤的活检表明活化的抗CD19 CAR-T细胞可以浸润肿瘤；然而，PMLBCL克隆在表面CD19上不存在，但显示阳性细胞质表达。这些发现意味着通过流式细胞术和免疫组化法同时评价CD19的细胞质和膜表达可能是有意义的。

抵消肿瘤抗原缺失复发的新策略主要针对能够识别多种抗原的T细胞，其中双靶向CAR-T细胞已经在临床前研究中具有两种主要模式：用两种不同的CAR分子具有两个不同的结合域（称为双信号CAR）或具有一个CAR分子包含串联的两个不同的结合结构域（称为TanCAR）。双重靶向CAR（双重信号CAR或TanCAR）的前提条件是，任一抗原都可以触发强大的抗肿瘤活性，该概念很简单，但在临床验证的抗原的有限选择和在TanCAR的设置中合适的表位选择的约束的背景下仍是一个挑战。除了CD19，其他泛B细胞标记物例如CD20和CD22也可以作为B细胞恶性肿瘤中的双靶向CAR的靶标，因为在早期临床试验中，这些抗原定向的CAR已经在人体中测试中呈现较好的结果。此外，CD123（也称为IL-3受体α链）也是双靶点CAR的理想选择。值得注意的是，当两种抗原在肿瘤细胞表面表达时，与非特异性CAR或混合的非特异性CAR相比，双重信号CAR或TanCAR显示出增强的抗肿瘤活性，突出了安全性问题。

另一方面，选择性靶向癌症干细胞（CSCs）用于CAR-T细胞治疗效果更好，其原因是CSCs保留广泛的自我更新和致瘤潜力，可以确定肿瘤的行为。当靶向CSCs时，CD133是CAR-T细胞治疗的有吸引力的治疗靶标。我们首先测试了以短暂启动子为特征的CD133定向的CAR，以尽量减少在on target/off-tumor识别的风险。在抗EGFR CAR-T细胞治疗后进展的胆管癌患者，有严重但可以控制表皮/内皮毒性的另一部分反应，这可能是由于与在正常上皮和血管内皮上表达的CD133的交叉反应。这些研究结果表明抗CD133 CAR具有有效的抗肿瘤免疫，有助于长期疾病控制。

同时，应该注意内源性免疫系统，虽然它不能有效对抗肿瘤细胞，因为缺乏足够的肿瘤特异性T细胞以及抑制肿瘤免疫的微环境。免疫系统最彻底的重建是同种异体干细胞移植（allo-SCT），接受CAR-T细胞治疗后，B-ALL达到CR的患者在几个机构进行了allo-SCT，结果表明复发率降低。然而，纪念斯隆凯特林癌症中心（MSKCC）表示，在6个月的总生存期（OS）中，CAR-T细胞输注后的36名患者和接受allo-SCT（70％）的患者之间没有明显差异。我们建议对CAR-T细胞治疗后实现CR的B-ALL患者采用巩固性异源SCT，而不考虑CAR-T细胞在体内的持续性，特别是有更高复发风险的患者。

如何提高实体瘤中CAR-T细胞的安全性

CAR-T是肿瘤免疫治疗的重要手段，具有较强的抗肿瘤活性，但临床毒副反应明显。CAR-T细胞可通过识别共表达靶抗原及交叉抗原的组织等机制,引起肿瘤溶解综合征(tumor lysis syndrome,TLS)和细胞因子释放综合征(cytokinerelease syndrome,CRS)等全身性损伤。如何消除这些毒性则至关重要，也是目前研究的重点。目前用于增强实体瘤中CAR-T细胞治疗的安全性的策略分为几类（表2）。

提高CAR的选择性

1、选择安全的抗原

CAR只能攻击表达靶向抗原的细胞，因此克服肿瘤外毒性而不降低其疗效的最直接和有效的方法是通过靶向仅在肿瘤细胞上表达的真正的肿瘤特异性抗原。然而，绝大多数CAR靶标是肿瘤相关抗原（TAA）。迄今为止，CAR的唯一的肿瘤特异性抗原是EGFRvIII，其严格局限于人类癌症（最常见于胶质母细胞瘤中）。EGFRvIII特异性CAR在9名EGFRvIII阳性胶质母细胞瘤患者的早期结果中表明输注是良好耐受的，并且没有off-tumor毒性。

值得注意的是，Posey等证明异常糖基化抗原-Tn-MUC1也可以作为CAR-T细胞治疗的理想靶标，因为表达5E5 CAR的T细胞已经实现了对Tn-和STn-阳性恶性肿瘤的选择性识别。此外，还观察到5E5 CAR-T细胞在诸如白血病和胰腺癌等多种癌症的鼠模型中强大的细胞毒性。但目前还有待进一步的研究证实异常糖基化抗原可以作为比TAA更安全的替代CAR-T细胞治疗。

2、靶向组合抗原

CAR-T细胞治疗的高度特异性靶标非常少，对于大多数TAA，用于增强CAR特异性的一种策略是组合抗原（主要是双抗原）而不是单靶向抗原，使CAR-T细胞具有区分靶细胞和脱靶细胞的能力。

3、调节CAR的敏感性

众所周知，更高亲和力的TCR可以改善靶抗原的识别。然而，除了用于最大的T细胞抗肿瘤活性的TCR亲和阈值之外，通过进一步的改进并不能提高，甚至会减弱T细胞活化；此外，与其他自身衍生的pMHC复合物交叉反应的风险也可能增加。最近，两项研究进一步证明，通过改变CAR的亲和力，CAR-T细胞可以区分肿瘤细胞和表达较弱的或正常水平相同抗原的正常细胞，同时在体内保留有效的功效。CAR对scFv的最佳亲和力还取决于靶表位的位置，抗原密度，间隔区的长度和其它参数，因此，为了得到最优的CAR设计，各个参数的分析测试是必要的。

控制CAR-T细胞活性

1、限制CAR的表达

2、可切换的CAR

3、自杀基因

结论

CAR-T细胞是T细胞基因工程最好的例子，在未来1 - 2年内有希望成为治疗B细胞恶性肿瘤的主流。但是由于CAR-T细胞的选择性免疫压力导致的肿瘤抗原逃避复发暴露了这种新型方式的缺点。此外，在应用具有较低功效和靶向/离体肿瘤毒性的实体瘤中没有引起类似的惊喜，表明增强CAR-T细胞的功效和安全性应该被认为是该新型的起点CAR设计。令人鼓舞的是，上述用于解决这些问题的验证设计已经在实验研究中进行了测试，提供了可行性的初步证据，并为进一步优化奠定了基础。在这些设计中，即双靶向CAR应该占据前排，因为它不仅有益于减少或预防血液恶性肿瘤或实体瘤中抗原逃避复发的风险，而且可以减轻抗原异质性对实体瘤治疗效果的影响。然而，用于成功抵消抗原缺失复发的双靶向CAR的前提是，它可以有效地杀伤表达任一抗原的靶标，类似于单特异性CAR。这对实体肿瘤中的实施方案施加了限制，因为与非特异性CAR相比，双靶向CAR可能增强靶向/脱离肿瘤识别的风险。

事实上，如上所述，在实体肿瘤中使用多靶标CAR-T细胞治疗的概念主要集中在通过组合抗原靶向的设计来增强CAR的特异性，由此T细胞可以完全激活两种同时存在的靶抗原。最重要的是，双靶向CAR是克服抗原逃避复发的最佳方法，在B细胞恶性肿瘤中具有可控的on target/off-tumor毒性；然而，因为难以平衡治疗效果和on target/off-tumor毒性，所以在实体瘤中实施仍然是有挑战性的。通过scFv亲和力与自杀基因组合调整CAR的敏感性可能是扩大双靶点CAR超越血液恶性肿瘤应用的强大战略。然而，这些新颖设计的最终效果仍需要在临床试验中确定。

参考文献：

J Hematol Oncol. 2017; 10: 53.

Published online 2017 Feb 21. doi: 10.1186/s13045-017-0423-1