近日，来自Georgetown University Medical Center （GUMC）的研究人员在《Nature Protocol》上发表了一项革命性的实验技术-条件性重编程（Conditioanl Reprogramming，CR）。这种技术摆脱了传统方法的束缚，让肿瘤细胞以及正常细胞可在体外无限增殖。经过若干年的不断实践和改进，这种实验方法已经比较成熟，可以帮助科学家们高效地在体外培养组织细胞，极大地提高研究效率。这或许将如同CRISPR技术一样，成为生物医学研究的又一大基石。

长期以来，在体外培养组织细胞并构建前临床模型，一直是生物医药领域重要的研究方法。细胞模型不仅可以帮助科学家们更好地理解疾病的分子机理，产生原因，还可以协助药物发现和新疗法的开发。这对于近年来新兴的干细胞研究，精准医学和再生医学，更是有着深远的意义。

然而，从体内提取细胞虽然简单，但如何让这些细胞在体外“茁壮成长”却是一大难题。

对于正常的成年细胞（adult cell）来说，它们已经失去了无限增殖和分化的能力。每一次细胞的分裂，都会使它们迈向衰老，让增殖能力减弱-当到达一定分裂次数后，细胞会停止分裂，逐渐衰亡。因此，想要将体内的细胞提取出来，在自然状态下长期保持增殖活力，是不可能的。所以，科学家们采用了各种手段，来延长体外培养细胞的“寿命”。例如，可以利用病毒致癌基因来改造宿主细胞的基因组，更改由p53调控的细胞周期，从而让这些细胞冲破衰老的界限-比如SV40的大型T抗原（large T antigen）以及乳头瘤病毒（papillomavirus）的E6/E7蛋白。另外，如果在基因组植入人类的端粒酶反转录酶（hTERT）和cdk4，也可以让人体成年细胞获得永生性。近年来十分火热的诱导干细胞（iPSC）也可以利用细胞重编程（reprogramming）的方式，使细胞重新获得无限增殖的能力。然而，现有方法的缺陷在于它们必须改变细胞本身的基因型和表现型，从而影响细胞本身的特征，甚至产生难以预测的副作用。另外，这些方法的效率相对来说并不高，难以被大量使用。

你一定会想，肿瘤细胞天生具有无限增殖的能力，是不是在体外培养它们就比较简单了呢？其实不然-使用传统的方法在体外培养人源肿瘤细胞，成功率仅有1-10%！肿瘤的生长过程十分复杂，极度依赖肿瘤微环境的调控，如其它细胞供给的生长因子。如果肿瘤细胞脱离了这个环境，就难以保持活跃的增殖状态。更重要的一点在于：用传统方法培养肿瘤组织，无法保持其肿瘤异质性（tumor heterogenecity）。许多研究已经表明，肿瘤组织的细胞类型并不是单一的，而是由许多不同基因型和表现型的肿瘤细胞系组成。对于每个肿瘤病人，这种细胞系的组成都是有区别的。对肿瘤异质性进行研究，能够帮助我们理解肿瘤的病理病因，甚至对病人的治疗和用药给出指导方向。然而，传统方法培养的肿瘤细胞，都是单一的细胞系，难以获得这种信息。

那么，有没有一种体外培养方法，能够使肿瘤细胞和正常细胞都获得无限增殖的能力，同时又不改变其本身的特征？

在2011年，来自GUMC细胞重编程研究中心的主任Richard Schlegel Liu率先找到了这个难题的答案：条件性重编程（CR）。不过，在当年，这项技术并不成熟，应用范围也很窄。经过多年的不断探索，CR在世界范围内被广泛接受-科学家们已经利用这种技术，成功地在体外培养了呼吸道，小肠，前列腺，视网膜等多种组织的正常细胞以及癌细胞。美国癌症学会也将其纳入了精准医疗行动的范例技术。近年来，GUMC的工作人员们已经对100余位科学家进行了这项技术的培训工作，帮助他们解决培养细胞的难题。

目前，CR是世界上唯一一个可以同时对癌细胞和正常细胞进行无限增殖的实验技术。Richard Schlegel Liu表示：“只需要将细胞从病人体内提取出来，就可以进行扩增。当我们需要的时候，一周之内就能增殖100万以上的细胞。”

在最新发表的文章中，研究人员们总结了对这项经过多次改良的技术，并整理成了简单明了的实验步骤，能够让读者们迅速掌握它。大家应该了解，《Nature Protocol》上面的文章都对实验步骤和原理有着详细的描述。所以本文不再赘述，就简单介绍一下最关键的“重编程”部分。

传统意义上的重编程，是改变细胞内的特定基因，从而能够人工调控细胞的行为。这项技术中所谓“条件性重编程“，却是利用了培养基环境的”条件“，并未改变细胞本身的基因型。

第一个条件就是在培养基中加入Swiss 3T3 J2 小鼠纤维原细胞（fibroblast），充当目标组织细胞的”饲养者”（feeder）。也就是说，这些细胞将成为目标组织细胞的“食物”，因为它们能够提供目标细胞生长分化所必须的调控因子。这种利用一种细胞“饲养”另一种细胞的方法已经被广泛应用，被成为“共培养”（co-culture）。然而，如果feeder细胞过多，会不利于目标细胞的生长。因此，在加入培养基之前，所有feeder细胞都经过了致死剂量的射线处理，使大部分细胞失去活性。

第二个条件则是在培养基中加入ROCK（Rho激酶）抑制剂Y-27632。之前的研究表明，这种抑制剂可以诱导细胞获得无限增殖的能力。

这种神奇的“条件性重编程”，其原理并未完全被揭示。最新研究表明，其效果接近于HPV-16中的E6,E7蛋白：E6蛋白和feeder细胞都可以激活端粒酶，而E7蛋白和Y-27632都可以扰乱actin细胞骨骼。

具体实验步骤请参考原文：

http://www.nature.com/nprot/journal/v12/n2/full/nprot.2016.174.html

这项技术的突破性意义在于：

可以直接提取组织，进行体外培养。这些组织将保留细胞的层级分布，以及可分化的能力。也就是说，经过培养的细胞能够包含多种细胞系，同时具有分化为组织的能力。例如，将经过培养的前列腺细胞注射到免疫缺陷小鼠的肾小囊中后，能够分化为完整的前列腺表皮组织。

无需改变细胞本身的基因型和表现型，在自然状态下进行生长，不会对于细胞和组织的发育产生副作用。

能够保留癌细胞本身的基因型和表现型，完整地保留癌细胞的特征，有助于癌症模型的构建。

操作过程相对简单，无需复杂的手段。只需要两天时间，即可完成诱导，使细胞开始无限增殖。

生长可控性。可以通过改变培养基环境，是生长和分化停止或继续。

这项实验技术究竟会为生物医学的发展带来哪些重大贡献呢？

首先，CR可以让科学家们更好地研究疾病机理。在去年12月，Richard Schlegel Liu的研究小组就同时培养出了前列腺正常细胞和肿瘤细胞，为研究这种致死率最高的恶性肿瘤提供了新的基础。

其次，CR可以帮助科学家们开发新疗法。Richard Schlegel Liu的研究小组曾经成功地利用CR培养出了能够分泌胰岛素的胰岛Beta细胞。如果将健康的胰岛细胞植入病人体内，取代有缺陷的细胞，或许能够成为彻底治愈I型糖尿病的新疗法。

第三，CR或将成为新的药物发现平台。一个研究小组就曾成功地利用CR构建了前列腺肿瘤的细胞模型，并研究了多种新型药物的敏感性，如navitoclax。来自耶鲁大学的科学家们也利用CR取得了重大发现：SOX10和Notch1是腺囊癌的新型药物靶点。

第四，CR将帮助精准医学的发展。将病人的细胞在体外进行扩增，并进行基因和蛋白表达的检测，能够更好地了解个体疾病的特征，从而能够为病人量身打造疗法。

第五，由于CR可以保留细胞的分化能力，体外培养的细胞可被用于再生医学领域的研究，甚至能够在体外培养复杂的器官。

参考资料：

https://www.eurekalert.org/pub_releases/2017-01/gumc-sdl012017.php

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3349876

http://clincancerres.aacrjournals.org/content/22/8/2083.short

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030228381630080X